細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及回答

如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個好的開始，各種目的無血清培養(yǎng)好AIM V（12005）培養(yǎng)基（SFM）。

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞。活細(xì)胞排斥臺盼蘭，因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞。

如何消除組織培養(yǎng)的污染？

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

1. 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。
2. 分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3. 每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。
5. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。
6. 重復(fù)步驟4。
7. 在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。


培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

目錄上說，Hank's 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's 平衡鹽溶液（HBS）和Earle's平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。

我試用SF900 II時，細(xì)胞生長良好，但是我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好。

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達(dá)，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

20°C下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。

下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況：

例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

緩沖系統(tǒng) pKa/20℃ [ Delta]pKa/10℃

Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280


室溫下（25）配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

4°C 25°C 37°C
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5


昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)的適PH值和滲透壓是多少？

生長培養(yǎng)基的PH值對細(xì)胞的增殖和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細(xì)胞系，在PH值 6.0～6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細(xì)胞系時，培養(yǎng)基的適滲透壓是345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細(xì)胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。

High Five細(xì)胞有任何其它名稱嗎？

High Five細(xì)胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別

PFHM-II （Protein-free Hybridoma Medium）是不包含有蛋白質(zhì)的單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。如果作為雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基使用，PFHM-II可能需要補(bǔ)充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是雜交瘤生產(chǎn)培養(yǎng)基，也是單克隆抗體生產(chǎn)培養(yǎng)基。它包含低水平的蛋白質(zhì)。

在High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度是多少？

High Five無血清培養(yǎng)基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

High Five細(xì)胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml。

在我的果蠅培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細(xì)胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養(yǎng)基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復(fù)合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養(yǎng)條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強(qiáng)力推薦使用脫落細(xì)胞的方法，因為這項技術(shù)破壞性小，生活力高。正如手冊上所顯示，通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。


胰酶消化一個T25瓶的sf9細(xì)胞： 1. 去除培養(yǎng)基。
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5. 向細(xì)胞中加入2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6. 離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。
7. 用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。


在Sf9, Sf21, 和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時候計數(shù)時，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

Tech tips

● 貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，可能在放置幾天后顏色變紫。這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

● 如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

● 您要查找培養(yǎng)基成分表嗎？您可以在GIBCO 目錄*章的后面或在我們的技術(shù)資源部分找到。

● 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

● 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

● 總之，大部分添加物和試劑多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。

● 在進(jìn)行傳代培養(yǎng)時，我們強(qiáng)烈推薦進(jìn)行臺盼蘭活性記數(shù)。研究者常常通過一個簡單的稀釋（1∶4或1∶2）進(jìn)行傳代，不進(jìn)行活性檢測，您可能接種比你認(rèn)為的低的多的濃度的細(xì)胞，這常常可能導(dǎo)致生長緩慢或培養(yǎng)物根本不生長。

● 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。

● GIBCO 產(chǎn)品的貯存期立足于實時穩(wěn)定性研究結(jié)果。產(chǎn)品說明在超過的貯存期的一段時間內(nèi)，產(chǎn)品仍然在可接受的范圍內(nèi)，但是由于在超過的效期后，產(chǎn)品的性能和穩(wěn)定性沒有檢測，我們不推薦使用過了效期的產(chǎn)品。