用于檢測未知抗體的間接法
更新時間：2012-06-04 | 點擊率：3953
用于檢測未知抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，
4℃過夜。次日洗滌3次。
↓
加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應孔中,
置37℃孵育1小時，洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照） 于反
應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育
30-60分鐘，洗滌,后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
操作要點：
1 標本的準備
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾
液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體
或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些
則需經預處理（如糞便和某些分泌物）
2 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾
水或去離子水，包括用于洗滌的鹽，應為新鮮和高品質的。自配的
緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與
室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱
保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。
加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并
注意不可濺出，不可產生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應
更換吸嘴，以免發生交叉污染。有時測定（如間接法ELISA）需用稀
釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔
中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩
1分鐘以保證混和。加酶結合液和底物反應液時可用定量多道加液
器，使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。
抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為
溫育。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。
以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是
都有均等的和固相抗體結合的機會，只有貼近孔壁的一層溶液中
的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散
才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合
也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃
是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫
度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原
抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達。為加速反
應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的
溫度。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在
冰箱中過夜，以形成多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中
一般不予采用。
保溫的方式除某些ELISA儀附有特制的電熱塊外，一般均采用水
浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度
迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮
膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA
板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底
墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱
中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是
水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅
速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍
內，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要
求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應
注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成
敗。ELSIA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目
的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物
質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚
苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種
非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌
是主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按
要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作
一般用浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將
洗滌液注滿板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置
1-2分鐘，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。
吸干應*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾
或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在
間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
6 顯色和比色
（1） 顯色
顯色是ELISA中的后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成
有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間
內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適
當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反
應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，
時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的
顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再
延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，
顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD
產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應邊觀
察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結
果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，
至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和
十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚
能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止
劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定
的波長（450nm）測讀吸光值。
（2） 比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放
入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標
準96孔的座架中，才可進行比色。好在加底物液顯色前，先將軟
板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。
比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液
的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記
錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各
孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。
比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用
吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸
收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方
法為"A492nm"或"OD492nm"。
（3） 酶標比色儀
酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指于測讀ELISA結果吸光度的光
度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試
管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指
標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、度和可測范圍、
線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可到0.001，準確性為±
1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔
相對于空氣的真實A值應為1.083±0.01（1.073~1.093），重復測定
數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀的可
測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000，
新型號的酶標儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A
值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的
不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為
0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制
作標準曲線時應予注意。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操
作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果
更穩定。測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm
波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，*
次在適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動
ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，終測
得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃
痕或指印等造成的光干擾。各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳
細閱讀說明書。
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