核酸分離純化技術(shù)是生物化學(xué)與分子生物學(xué)的一項(xiàng)技術(shù)
更新時(shí)間：2021-11-11 | 點(diǎn)擊率：2444
核酸分離純化技術(shù)是生物化學(xué)與分子生物學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及其相關(guān)等領(lǐng)域，核酸的分離與純化技術(shù)也得到進(jìn)一步發(fā)展。各種新方法、經(jīng)完善后的傳統(tǒng)經(jīng)典方法以及商品試劑方法的不斷出現(xiàn)，極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。現(xiàn)就核酸分離與純化的原理及其方法學(xué)進(jìn)展作一綜述。
核酸分離與純化的原則
核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。在分離核酸時(shí)應(yīng)遵循以下原則:保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性;排除其他分子污染。
核酸分離與純化的步驟
大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。
1.細(xì)胞裂解:核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來。細(xì)胞裂解可通過機(jī)械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實(shí)現(xiàn)。
(1)機(jī)械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎，但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂，因而不適用于高分子量長(zhǎng)鏈核酸的分離。有報(bào)道超聲裂解法提取的核酸片段長(zhǎng)度從<500bp～>20kb之間，而顆粒勻漿法提取的核酸一般<10kb。
(2)化學(xué)作用:在一定的pH環(huán)境和變性條件下，細(xì)胞破裂，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑或強(qiáng)離子劑而獲得。
而pH環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿或緩沖液提供。在一定的pH環(huán)境下，表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀，緩沖液中的一些金屬離子螯合劑可螯合對(duì)核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+、Ca2+，從而抑制核酸酶的活性，保護(hù)核酸不被降解。
(3)酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶)以使細(xì)胞破裂，核酸釋放。蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1，4)鍵水解。
蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65℃及有EDTA、尿素和去污劑存在時(shí)仍保留酶活性，這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中，酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。
2.酶處理:在核酸提取過程中，可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解，以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質(zhì)，滅活核酸酶，DNase和RNase也用于去除不需要的核酸。